阿維菌素類藥物酶聯免疫試劑盒質量標準

來源：  發布日期：2011-09-03  發布者：曉天  共閱1597次

本品系用阿維菌素藥物偶聯蛋白的抗原、阿維菌素類藥物多克隆抗體和酶標記羊抗兔及其它試劑制成。用于定量、定性檢測牛組織中阿維菌素類藥物的殘留量。

【物理性狀】 試劑盒外觀完整，內裝試劑齊全。包被抗原的酶聯板透明干燥且用真空包裝。阿維菌素類藥物抗體工作液、底物液、終止液、阿維菌素標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液為透明溶液，酶標記物為淺黃色溶液，試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】 取已包被好的酶標板12孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液各20?L，再加入抗體工作液80?L，用蓋板膜蓋板，37℃環境中反應30min，取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4－5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15 min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM濃度（?g/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。

IC50（即0濃度標準溶液的吸光度值50％處所對應的AVM濃度）范圍應在2.32?g/L ~4.57?g/L之間。

【特異性測定】 取已包被好的酶標板18孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液和牛肉樣品提取液、20?g/L和50?g/L兩個濃度阿維菌素添加的牛肉樣本提取液各20?L，再加入抗體工作液80?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應15 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15 min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以AVM濃度（?g/L）的自然對數為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和20?g/L和 50?g/L兩個濃度阿維菌素添加的組織樣品的測定濃度。

陰性樣品測定值在3?g/L以下，以20?g/kg 和50?g/kg 兩個濃度阿維菌素樣本進行添加，回收率應在60.0%~120.0％以上。

【精密度測定】 取已包被好的酶標板32孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L標準溶液20?L，其它20孔加入4.5?g/L的標準溶液20?L，再加入抗體工作液80?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30 min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15 min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的4.5?g/L標準溶液的光吸收值變異系數（%）應≤25%（n=20）

【適用范圍】　用于定量、定性檢測牛組織（肌肉、肝臟）中阿維菌素類藥物的殘留量。

【用法和結果判定】

1. 溶液配制

1.1 稀釋復溶液：將2X濃縮復溶液搖勻，用水以1：2比例稀釋，臨用前配制。

1.2 稀釋洗滌液：將20X濃縮洗滌液搖勻，用水以1：20比例稀釋，臨用前配制。

2. 樣品前處理

2.1 牛組織（牛肉、牛肝）樣本處理方法

2.1.1 取牛組織（肌肉、肝臟）進行均質。

2.1.2 稱取2±0.05g樣品，加入8mL乙腈，振蕩提取20min，3000g以上離心10min，取上清液5mL備用。

2.1.3 取sep-pak vac12cc(2g)柱，稱取3g無水硫酸鈉平鋪在濾板上，加入10mL乙腈溶液。

2.1.4 加入提取液5mL，收集濾液，待提取液流干，再加入4mL乙腈清洗殘留液。

2.1.5 將收集濾液置60℃下氮氣吹干，加入1mL稀釋了的復溶液復溶。

2.1.6 取20?L進行分析。

3. 檢測步驟

3.1 將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20~24℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

3.2 取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷凍。

3.3 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔。

3.4 用加樣器每孔加標準品或樣本20mL 后，每孔再加80mL抗體溶液。

3.5 用蓋板膜蓋板后置于37℃環境反應30min。

3.6 小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌液每孔250mL充分洗滌4~5次，每次間隔10~20s，用吸水紙拍干。

3.7 加酶標記物：每孔加入100mL。用蓋板膜蓋板后置37℃環境反應30min，取出重復洗板步驟。

3.8 顯色：每孔加入底物液A液50mL，再加底物液B液50mL，輕輕振蕩混勻37℃環境避光顯色15min。

3.9 測定：每孔加入終止液50mL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定每孔OD值。

4. 結果判定

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。


B


百分吸光度值（%）＝
—
×100%


B0



B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L標準溶液的平均吸光度值

以阿維菌素濃度的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。

【貯藏條件和保存期】試劑盒應在2~8℃保存，保存期為6個月。

【規格】每個試劑盒含96孔板一塊；AVM標準品6瓶，1mL/瓶（0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L）；抗體工作液1瓶，10mL；酶標記物工作液1瓶，12mL；20倍濃縮洗滌液1瓶，40mL；2倍濃縮復溶液1瓶，50mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；終止液1瓶，7mL；高濃度標準品（1?g/mL）1瓶，1mL；蓋板膜1張；自封袋1個；說明書1份；質量報告1份。

【注意事項】

1、劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證，合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、嚴格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象，則視該批試劑盒為不合格。

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