氟喹諾酮類藥物酶聯免疫試劑盒質量標準

來源：  發布日期：2011-09-03  發布者：曉天  共閱1577次

本品系用氟喹諾酮類藥物（QNS）偶聯蛋白成為抗原、氟喹諾酮類藥物類單克隆抗體和酶標記羊抗鼠及其它試劑制成。用于定量、定性檢測雞組織、蝦、血清等樣本中氟喹諾酮類藥物的殘留量。

【物理性狀】 試劑盒外觀完整，內裝試劑齊全。包被抗原的酶聯板透明干燥且用真空包裝，氟喹諾酮類藥物（QNS）抗體工作液、標準品溶液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液為透明溶液，酶標記物為淺黃色溶液，試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】 取已包被好的酶標板12孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液各50?L，然后加抗體工作液50 mL/孔，用蓋板膜蓋板，37℃環境中反應30min，取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干，加酶標物每孔100mL，用蓋板膜蓋板，置37℃環境中反應30min。取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，輕輕振蕩混勻，37℃環境避光顯色15min。用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每個濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以環丙沙星濃度（?g/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。

IC50（即0濃度標準溶液的吸光度值50％處所對應的環丙沙星濃度）范圍應在3.93?g/L ~5.49?g/L之間。

【特異性測定】 取已包被好的酶標板18孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液和陰性雞肉樣本提取液、20?g/kg和50?g/kg 兩個濃度環丙沙星添加的陽性雞肉樣本提取液各50?L，然后加抗體工作液50 mL/孔，用蓋板膜蓋板，37℃環境中反應30min，取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。加酶標記物每孔100mL，用蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，輕輕振蕩混勻，37℃環境避光顯色15min。用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每個濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以環丙沙星濃度（?g/L）的自然對數為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和20?g/kg和50?g/kg 環丙沙星添加的組織樣品的測定濃度。

陰性樣品測定值在4?g/kg以下，按20?g/kg 和50?g/kg 兩個濃度分別將環丙沙星對雞肉、雞肝、蝦、血清進行添加，回收率應在50.0%~130.0%之間。

【精密度測定】 取已包被好的酶標板32孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液50?L，其它20孔加入9?g/L的標準溶液50?L，，然后加抗體工作液50 mL，用蓋板膜蓋板，37℃環境中反應30min，取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。加酶標物每孔100mL，用蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。取出用洗滌液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，輕輕振蕩混勻，37℃環境避光顯色15min。用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的9?g/L標準溶液的光吸收值變異系數（%）應≤25%（n=20）

【適用范圍】　用于定量、定性檢測雞組織（肌肉、肝臟等）、蝦、血清等樣本中氟喹諾酮類藥物的殘留量。

【用法和結果判定】

1.溶液配制：

1.1 PB溶液的配制：稱取磷酸氫二鈉2.58g磷酸二氫鈉0.44g溶于500ml去離子水中。

1.2 稀釋濃縮復溶液：將2X濃縮復溶液搖勻，用水以1：2的比例稀釋，臨用前配制。

1.3 稀釋濃縮洗滌液：將20X濃縮洗滌液搖勻，用水以1：20比例稀釋，臨用前配制。

2.　 樣品前處理

2.1　 雞組織(肌肉、肝臟等)、蝦樣本處理方法

2.1.1稱2.0g均質過的組織樣本于50mL離心管中。

2.1.2加入乙腈─NaOH溶液10mL。充分混合10min，3000g以上，15℃離心10min。

2.1.3取上層液5mL，加入5mL的PB緩沖液，再加入正己烷4mL，混合2min，3000g以上，15℃離心10min，除去上層有機相。

2.1.4加入二氯甲烷8mL，充分混勻10min，3000g以上， 15℃離心10min。去上層，取下層有機相移到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干或用氮氣吹干。

2.1.5用0.6mL稀釋了的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃離心5min。

2.1.6輕吸掉上層有機相和中間部份液體，取下層50mL+50mL稀釋了的復溶液混勻即可分析。

2.2　 雞血樣本處理方法

2.2.1 用加有肝素鈉（20~30單位/mL血）的離心管采集雞血樣本（采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后3000g以上，15℃離心10min，取出血漿/血清1mL。

2.2.2 加入乙腈4mL充分混合10min，3000g以上，15℃離心10min。

2.2.3 移上清至另一離心管中，加入2mL PB緩沖液，混勻。

2.2.4 加入二氯甲烷5mL，充分混勻10min，3000g以上， 15℃離心10min。去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干或用氮氣吹干。

2.2.5 用0.6mL 稀釋了的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃離心5min。

2.2.6 輕吸掉上層有機相和中間白色雜質，取下層50mL和50mL稀釋了的復溶液混勻即可分析。

3.　 檢測步驟

3.1 將所需試劑從冷藏環境中取出，置室溫（20~24℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

3.2 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔條重新密封，保存于2~8℃。

3.3 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔。

3.4 加標準品或樣本 50mL，然后各加入抗體工作液50mL，用蓋板膜蓋板，37℃環境中反應30min。

3.5 取出用稀釋后的洗滌液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。

3.6 加酶標記物，每孔100mL，用蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。取出用洗滌液按每孔250μL,洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水紙拍干。

3.7 顯色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，輕輕振蕩混勻，37℃環境避光顯色15min。

3.8 測定：每孔加入終止液50mL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定吸光度值（OD值）。

4．結果判定

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。


B


百分吸光度值（%）＝
—
×100%


B0



B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L標準溶液的平均吸光度值

以環丙沙星濃度的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。

【貯藏條件和保存期】試劑盒應在2~8℃保存，保存期為6個月。

【規格】 每個試劑盒含96孔板一塊；環丙沙星標準品6瓶，1mL/瓶（0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、 81?g/L）；QNS抗體工作液1瓶，10mL；酶標記工作液1瓶，12mL；20倍濃縮洗滌液1瓶，40mL；2X濃縮復溶液1瓶，50ml；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；終止液1瓶，7mL；高濃度標準品（1?g/mL）1瓶，1mL；蓋板膜1張；自封袋1個；說明書1份；質量報告1份。

【注意事項】

1、試劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證，合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象，則視該批試劑盒為不合格。

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