磺胺類藥物多殘留酶聯免疫試劑盒質量標準

來源：  發布日期：2011-09-03  發布者：曉天  共閱1688次

本品系用磺胺類藥物（SAs）偶聯的抗原、SAs單克隆抗體和酶標記羊抗鼠及其它試劑制成。用于定量、定性檢測雞組織、雞蛋、尿、蜂蜜等樣本中磺胺類藥物的殘留量。

【物理性狀】試劑盒外觀完整，內裝試劑齊全。包被抗原的酶標板透明、干燥且用真空包裝，磺胺類藥物（SAs）抗體工作液、底物液、終止液、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮提取液為透明溶液，酶標記物為淺黃色溶液。試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】 取已包被好的酶標板12孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液各20?L，然后加入酶標記物各50?L，再加入SAs 抗體工作液各80?L，用蓋板膜蓋板，25℃反應1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反應20～30min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以SAs濃度（?g/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。

IC50（即0濃度標準溶液的吸光度值50％處所對應的SAs濃度）范圍應在1.64?g/L ~3.54?g/L之間。

【特異性測定】 取已包被好的酶標板18孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液和陰性雞肉樣本提取液、50?g/kg 和100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的陽性雞肉組織樣本提取液各20?L，加入酶標物50?L，再加入SAs抗體工作液80?L， 25℃反應1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反應20～30 min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值平均值（B）除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以SAs濃度（?g/L）的自然對數為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和50?g/kg和100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的雞肉組織樣品的測定濃度。

陰性樣品測定值在2?g/kg以下，50?g/kg 和100?g/kg兩個濃度磺胺二甲基嘧啶添加回收率在65.0%～120.0％之間?！?

　 【精密度測定】 取已包被好的酶標板32孔，每兩孔分別加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L標準溶液20?L，其它20孔加入9?g/L的標準溶液20?L，再加入酶標物50?L，再加入SAs 抗體工作液80?L，25℃反應1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反應20～30 min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的9?g/L標準溶液的吸光度值變異系數（%）應≤25%（n=20）。

【適用范圍】 用于定量、定性檢測雞組織（肌肉、肝臟等）、雞蛋、蜂蜜、尿液等樣品中磺胺類藥物的殘留量。

【用法和結果判定】

1. 溶液的配制

1.1 2M NaCL溶液：稱取11.69gNaCL　 加入100mL水溶解。

1.2 稀釋提取液：將20X濃縮提取液搖勻，用水以1：20的比例稀釋，臨用前配制。

1.3 稀釋洗滌液：將20X濃縮洗滌液搖勻，用水以1：20的比例稀釋，臨用前配制。

2. 樣本前處理

2.1 雞組織（肌肉、肝臟等）樣本處理方法

2.1.1 取適量雞組織，用勻漿機10000r/min勻漿1 min，稱取5±0.05g勻漿物置離心管中，加入15mL乙腈－水溶液（84+16，v/v）混合，劇烈振蕩10min。于15℃，3000g以上速度離心10min。

2.1.2 取3mL上清液，加入2mL水和5mL乙酸乙酯，混合振蕩10min，15℃，3000g以上速度離心5min。

2.1.3 將上層液移另一管中用氮氣吹干（或雞心瓶中，50℃減壓蒸干）。

2.1.4 用異辛烷或正己烷1mL溶解干燥的殘留物，加入稀釋了的提取液1mL振蕩2min。15℃，3000g，離心5min，除去上層液。

2.1.5 取20μL水相進行分析。

2.2　 雞蛋樣本處理方法

樣本處理方法同動物組織處理方法。

2.3　 蜂蜜樣本處理方法

稱取1g蜂蜜樣本于50mL離心管中，加入2mL PB緩沖液，再加入8mL乙酸乙酯，振蕩萃取10min，3000g以上離心10min,取上層液體于50℃下氮氣吹干，加1mL稀釋了的提取液復溶，取20mL進行分析。

2.4 尿液樣本處理方法

2.4.1取2mL尿液，加入8mL乙酸乙酯，震蕩萃取10min，3000g以上離心10min,取上層液4mL，于50℃下氮氣吹干，加1mL稀釋了的提取液復溶。

2.4.2 取20μL進行分析

3. 檢測步驟

3.1 將所需試劑從冷藏環境中取出，置室溫（20~24℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

3.2 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3.3 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔。

3.4 反應：往酶標板微孔中加標準溶液或樣本溶液20?L，加酶標記物50?L，然后加入磺胺類抗體工作液80 ?L，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應1h。倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250?L洗滌液，30秒后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。

3.5 顯色：每孔加入A、B底物液各50?L，輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色20~30min。

3.6 測定：每孔加入終止液50mL，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定吸光度值（OD值）。

4. 結果判定

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。


B


百分吸光度值（%）＝
—
×100%


B0



B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L標準溶液的平均吸光度值

以磺胺藥物濃度的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。

【貯藏條件和保存期】試劑盒應在2~8℃保存，保存期為6個月。

【規格】 每個試劑盒含96孔板一塊；標準品溶液6瓶，1mL/瓶（0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、 81?g/L）；SAs抗體工作液1瓶，10mL；酶標二抗工作液1瓶，7mL；20倍濃縮洗滌液1瓶，40mL；20倍濃縮提取液1瓶，50 mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；終止液1瓶，7mL；高濃度標準品（1?g/mL）1瓶，1mL；蓋板膜1張；自封袋1個；說明書1份；質量報告1份。

【注意事項】

1、試劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證，合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象，則視該批試劑盒為不合格。

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