克侖特羅酶聯免疫試劑盒質量標準

來源：  發布日期：2011-09-03  發布者：曉天  共閱1783次

本品系用克侖特羅偶聯蛋白的抗原，克侖特羅單克隆抗體和酶標記羊抗鼠及其它試劑制成。用于定量、定性檢測豬組織和尿液中克侖特羅的殘留量。

【物理性狀】試劑盒外觀完整，內裝試劑齊全。包被抗原的酶聯板透明干燥且用真空包裝?？藖鎏亓_抗體工作液、底物液、終止液、標準品溶液、濃縮洗滌液為透明溶液，酶標記物為淺黃色溶液，試劑無菌檢驗均應合格。

【靈敏度測定】取已包被好的酶標板12孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L標準溶液各20?L，再加入克侖特羅抗體工作液80?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以克侖特羅濃度（?g/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。

IC50（即0濃度標準溶液的吸光度值50％處所對應的克侖特羅濃度）范圍應在0.25?g/L~0.56?g/L之間。

【特異性測定】取已包被好的酶標板18孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L標準溶液和陰性尿樣本提取液、1?g/L和2?g/L克侖特羅添加的陽性尿樣本提取液各20?L，再加入克侖特羅抗體工作液80?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。每一濃度標準溶液吸光度值（B）平均值除以第一個標準（0標準）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以克侖特羅濃度（?g/L）的自然對數為X軸，百分吸光度為Y軸，繪制標準曲線圖。從標準曲線中查出陰性樣品和1?g/L和2?g/L克侖特羅添加的尿樣的測定濃度。

陰性尿樣本測定值在0.25?g/L以下，1?g/L和2?g/L克侖特羅添加濃度回收率應在55.0%~120.0%之間。



【精密度測定】 取已包被好的酶標板32孔，每兩孔分別加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L標準溶液20?L，其它20孔加入0.9?g/L的標準溶液20?L，再加入克侖特羅抗體工作液80?L，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶標二抗，37℃反應30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反應15min，用50?L終止液終止反應，置450nm波長處測定吸光度值。

20個微孔的0.9?g/L標準溶液的吸光度值變異系數（%）應≤25%（n=20）。

【適用范圍】用于定量、定性檢測豬組織（肌肉、肝臟等）和尿液中克侖特羅的殘留量。

【用法和結果判定】

1. 溶液配制

1.1 稀釋洗滌液：將20X濃縮洗滌液搖勻，用去離子水以1：20的比例稀釋，臨用前配制。

1.2 0.05M鹽酸液： 取鹽酸4.2mL，加水至1000mL。

1.3 0.05M磷酸鹽緩沖液（pH3.0）：稱取磷酸二氫鉀6.8g，加水900mL，用稀磷酸調節pH至3.0，用水稀釋至1000mL。

1.4 0.5M磷酸鹽緩沖液(pH 3.0)： 稱取磷酸二氫鉀68g，加水900mL，用磷酸調節pH至3.0，用水稀釋至1000mL。

2、樣品的前處理

2.1豬組織（肌肉、肝臟等）樣本處理方法

2.1.1 5.0g粉碎的樣品與25mL 0.05M HCL混合，振蕩1.5h，以達到均質的目的；

2.1.2 稱6g均質物（相當于1g肝臟），加入離心瓶中；

2.1.3 10~15℃，3000g以上的轉速離心15min；

2.1.4 轉移上清液到另一個離心瓶中，加300?L 1M NaOH混合15min；

2.1.5 加入4mL 0.5M磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡單的混合后在4℃保存，至少1.5h或過夜（非常重要）；

2.1.6 10~15℃，3000g以上的轉速離心15min，分離全部上清液（應該是清亮的，非常重要），使其升至室溫（20~24℃），然后用RIDA C18柱純化（見RIDA C18柱純化步驟）。

2.2 尿樣本處理方法

尿樣不用處理，取20?L清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或3000g離心15℃，10min直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣品應冷凍保存。

3. RIDA C18柱純化步驟

3.1 用3mL甲醇（100%）洗滌柱子，流速為1d/s；

3.2用2mL洗滌液洗滌柱子（0.05M磷酸二氫鉀緩沖液，pH3.0）；

3.3 樣品進柱（肝，肉或組織的全部上清液）；

3.4 用2mL洗滌液洗滌柱子（0.05M磷酸二氫鉀緩沖液，pH3.0）；

3.5 用正壓去除殘留的流體并且用空氣或氮氣吹2min干燥柱子；

3.6 用2mL甲醇（100%）洗脫樣品，流速為15d/min；

3.7 用50~60℃的弱空氣或氮氣流下完全蒸發溶劑；

3.8用1mL去離子水溶解干燥的殘留物，取20?L進行分析。

4.　 檢測步驟

4.1 將試劑盒從4℃冷藏環境中取出并將所需試劑從盒中取出，置于室溫（20~24℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

4.2 取出需要數量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2~8℃，不要冷凍；

4.3 編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做2孔；

4.4 反應：往酶標板微孔中加標準溶液或試樣溶液20?L，然后加入已稀釋好的克侖特羅抗體工作液80?L，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應30min。

4.5 倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250?L洗滌液，15s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。

4.6 加酶標記物：加入酶標記物100?L，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應30min。取出酶標板，如前述洗板5次；

4.7 顯色：每孔加入A、B底物液各50?L，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min；

4.8 測定：每孔加入終止液50?L，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測），測定每孔吸光度值（OD值）。

5、結果判定

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝
B
×100%

B0



B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以克侖特羅標準品濃度的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克侖特羅實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

【貯藏條件和保存期】試劑盒應在2~8℃保存，保存期為6個月。

【規格】每個試劑盒含96孔板1塊；克侖特羅標準品6瓶，1mL/瓶（0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L）；克侖特羅抗體工作液1瓶，7mL；酶標記物工作液1瓶，12mL；20倍濃縮洗滌液1瓶，40mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；終止液1瓶，7mL；高濃度標準品（1?g/mL）1瓶，1mL；蓋板膜1張；自封袋1個；說明書1份；質量報告1份。

【注意事項】

1、試劑盒在緩沖液配制和液體分裝上要做到無菌，防止試劑變質。

2、試劑盒標準品應經過嚴格配制后方可用于試劑盒中。

3、添加回收用的高濃度標準品需經過試劑盒自身標準驗證，合格后方可用于特異性和準確度監控用。

4、格按照質量標準所述用法和結果判定內容進行試劑盒質量控制。

5、在試劑盒老化實驗中出現有不合格現象，則視該批試劑盒為不合格。

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