摘要：

　　非洲豬瘟是重要的豬傳染性疾病，目前尚無針對非洲豬瘟的有效疫苗，也沒有合適的處置措施。本研究發現氟喹諾酮類藥物具有抗非洲豬瘟的活性。當將非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)早期感染的vero細胞暴露于6種不同的氟喹諾酮類藥物或他們的組合時，可以發現ASFV所導致的vero細胞的病變效應大幅的下降。此外，經過7天的藥物處理，甚至無法通過PCR手段檢出ASFV的核酸，而且培養液的上清不能感染新的細胞培養物。脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析發現經氟喹諾酮類藥物處理后，細胞中病毒DNA的量有所下降，但是并未檢測到病毒基因組碎片。在平行組中還發現病毒早期蛋白合成模式有所變化。本研究試驗結果說明，細菌的拓撲異構酶抑制劑可能通過抑制假定的ASFV的2型拓撲異構酶來抑制ASFV的復制，這一研究結果為非洲豬瘟的治療開辟了新的路徑。

　　1. 簡介

　　非洲豬瘟是一種嚴重威脅養豬業的疾病。非洲豬瘟在撒哈拉以南非洲國家是一種地方性流行病，該病于2007年又經格魯吉亞傳入歐洲大陸。從那時起，非洲豬瘟就不斷的傳播至鄰近的國家或地區，從而徹底的改變了歐洲的非洲豬瘟形勢。除了已感染非洲豬瘟的國家和地區以外，其他歐盟國家因與感染非瘟的國家地理位置較近的緣故，所以也是非瘟高風險地帶。俄羅斯聯邦及其周邊地區非洲豬瘟由于缺乏統一的控制方案，大量的沒有生物安全意識的散養戶的存在，以及用泔水喂豬的方式，導致了對非洲豬瘟的控制困難重重。

　　在這種形勢下，歐盟的非洲豬瘟也時刻存在著傳入東歐的風險，尤其是通過一些較難控制的途徑，比如野豬的遷移、動物或動物產品的非法調運、受污染的傳播媒介等。盡管已經投入了大量的時間和精力，但目前仍然沒有研制出一種可以控制非洲豬瘟的疫苗產品，而且非洲豬瘟的控制需要做到早期診斷和極為嚴格的生物安全措施，所以非洲豬瘟往往會給感染的國家帶來很大的經濟損失和社會危害。

　　非洲豬瘟的病原非洲豬瘟病毒是一種大DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科的唯一一個成員。非洲豬瘟病毒可以編碼2型拓撲異構酶(ASFV-TopoII)，這一點相比于其他可感染哺乳動物的病毒而言是十分獨特的。進化樹分析表明，ASFV-TopoII與宿主細胞的TopoII不在同一進化分支，并且還與細菌DNA回旋酶和4型拓撲異構酶有25%區域完全一致，由此人們想到通過細菌的拓撲異構酶抑制劑(如氟喹諾酮類)來干擾ASFV的復制。

　　氟喹諾酮類藥物具有抗菌活性，因為氟喹諾酮類藥物可以與細菌DNA回旋酶和4型拓撲異構酶形成藥-酶-DNA裂解復合物，從而干擾DNA的復制和促發細胞死亡(如氧化應激和基因組斷裂)。DNA回旋酶在DNA解鏈中發揮很大的作用，而4型拓撲異構酶在基因組分解過程中發揮很大的作用。

　　近期的研究發現氟喹諾酮類藥物分子結構所起的化學修飾作用是其“非典型”的抗病毒(RNA病毒或者DNA病毒)作用的物質基礎?？紤]到ASFV可以編碼2型拓撲異構酶，我們要通過試驗來分析這些抗生素是否對ASFV的DNA復制和蛋白質合成有抑制活性，本試驗用到的病毒株為Ba71V毒株，用到的培養細胞為Vero細胞。由于現在還沒有合適的非洲豬瘟疫苗以及有效的防控措施，如果能發現一種有效的抗病毒藥物，再將這種藥物用于非洲豬瘟的防控，那么對于預防非洲豬瘟的擴散必將發揮很大的作用，也可以為政府機構采取干預措施贏得時間。

　　2. 材料和方法(略)

　　3. 結果

　　3.1 感染了ASFV的Vero細胞培養于含特定氟喹諾酮類藥物培養基中，ASFV的細胞病變減輕

　　ASFV在感染進程中會伴隨有明顯的細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)、細胞凋亡和細胞死亡，本研究最開始評估30種氟喹諾酮類藥物的抗病毒性質時，就是參考的Vero細胞的CPE這一指標。一部分氟喹諾酮類藥物(恩諾沙星、格帕沙星、巴洛沙星、托氟沙星、加替沙星和加洛沙星)被證實在100μg/ml濃度時有抗病毒效應。被感染過的培養物在4小時后暴露于這些藥物7d時間后，其CPE會變小甚至消失，當在感染后72小時與未經處理的ASFV感染的Vero細胞作比較的時候，會發現經藥物處理組細胞接近于正常未感染的細胞。處理組感染ASFV的細胞會見到核碎裂所致細胞起泡，而不是典型的CPE現象。經藥物處理組大部分的細胞單層保持著典型的纖維素樣形態，而未經處理的細胞則表現出清晰的CPE現象，其質/核比例因此下降，如圖1a和圖1b。

　　圖1：藥物處理組與非藥物處理組細胞形態對比

3.2 經氟喹諾酮類藥物培養后，ASFV的感染性下降

　　為了評估氟喹諾酮類藥物對ASFV感染性的抑制，本研究測定了經藥物7天處理后病毒DNA的含量情況。結果發現用經選擇的藥物(100μg/ml)處理后，病毒DNA含量發生了很大的下降，有的甚至檢測不出DNA了。某些抗生素的抗ASFV作用還會顯示出劑量依賴效應，隨著抗生素濃度的增大(50μg/ml，75μg/ml和100μg/ml)，DNA的含量逐步變少(圖2A,條帶 3~29)。此外，一些氟喹諾酮類藥物的組合也具有很好的抑制ASFV的作用(2藥物組合：25+25μg/ml和50+50μg/ml，3藥物組合：15+15+15μg/ml和25+25+25μg/ml，圖2A,32~57)。經上述藥物或者藥物組合作用7天后，ASFV感染的Vero細胞上清液檢不到ASFV的DNA，而且該上清液也不能感染新的細胞培養物(圖2B, 條帶5，11, 14, 17, 23和26)。表1總結了能完全抑制ASFV核酸生成的藥物或者藥物組合。

　　圖2：各試驗組跑膠結果

　　3.3 氟喹諾酮類藥物抑制ASFV的復制，但不形成基因組碎片

　　氟喹諾酮類藥物殺菌機制是藥物可以和細菌核酸和拓撲異構酶形成DNA-拓撲異構酶-藥物解離復合物，使得細菌基因組碎片化。因此，我們為了探明氟喹諾酮類藥物抗ASFV的機制與殺菌機制是否一樣，特別進行本試驗來看看解離復合物是否存在，從而判斷二者作用機制是否一致。和預計的情形一樣，隨著ASFV感染滴度的增加，無論完整的還是不完整的病毒核酸的量都會增加(圖3，條帶4~6)，而經過藥物處理后，無論完整的基因組核酸還是不完整的基因組核酸的量都有所下降(圖3)，當抗生素的濃度為100μg/ml時，這種減少就更為顯著了(圖3，條帶12~14)，陰性對照組未檢測到病毒核酸條帶(圖3，條帶1和2)。此外，ASFV感染的細胞經依托泊苷(宿主細胞特異性的2型拓撲異構酶抑制劑)作用后，未見基因組碎片種類的增加，這表明宿主的2型拓撲異構酶未受到影響(圖3，條帶3)。本研究也未檢測到宿主細胞的基因組碎片，這說明氟喹諾酮類藥物對宿主細胞沒有產生影響，這與后續的MTS細胞毒性測定試驗的結果是一致的。

　　圖3：各個試驗組電泳圖

　　表1：能完全抑制ASFV核酸生成的藥物或者藥物組合

　　3.4 氟喹諾酮類藥物調節ASFV蛋白的合成

　　本研究通過Western blot技術對比了感染了ASFV的Vero細胞在經氟喹諾酮類藥物處理和未經處理的情況下病毒蛋白的合成情況。在感染的早期(6hpi)，經氟喹諾酮類藥物處理組的培養物其病毒蛋白的表達(圖4A, 條帶3~14)與未經藥物處理組的是不同的(圖4A, 條帶2)，其中兩種病毒蛋白(~63kDa和~20kDa)經可在藥物處理組見到，而一個小病毒蛋白(~17kDa)只能在未經藥物處理組見到。

在病毒感染的晚期(32hpi)，就只能在未經藥物處理組檢出大于50kDa的病毒蛋白了(圖4B, 條帶2)，而藥物處理組仍能檢出高水平的~35kDa的病毒蛋白和~17kDa的病毒蛋白(圖4B, 條帶3~14)。

　　圖4：各試驗組Western blot結果

　　3.5 氟喹諾酮類藥物，在抗病毒濃度下，顯示出低細胞毒性

　　經過7天的藥物處理后，6種效果較好的氟喹諾酮類藥物會對細胞生長產生抑制作用，本研究通過MTS試驗評估了藥物在100μg/ml濃度下對細胞生長的抑制作用。結果顯示抑制率從恩諾沙星的15%到巴洛沙星的40%不等(圖5)。而所有2藥物組合和3藥物組合相比于使用單藥都顯示出很低的細胞生長抑制作用。

　　圖5：各種藥物或者藥物組合對細胞生長活性的抑制

　　4. 討論

　　非洲豬瘟病毒科，藻類去氧核糖核酸病毒科和虹膜病毒科是目前所知的病毒科中僅有的可感染真核細胞還可以編碼2型拓撲異構酶的病毒科。由于2型拓撲異構酶在病毒DNA的復制中發揮著很大的作用，而氟喹諾酮類藥物又是該酶特定的抑制劑，所以用氟喹諾酮類藥物抑制病毒的復制就成為了一種新的治療選擇。前文提到細菌DNA回旋酶/4型拓撲異構酶和ASFV的2型拓撲異構酶有一定的序列相似度，為此，本研究評估了30種用作抗生素的拓撲異構酶抑制劑對ASFV是否有抑制作用。

　　研究的結果顯示，恩諾沙星、格帕沙星、巴洛沙星、托氟沙星、加替沙星和加洛沙星可減輕ASFV感染Vero細胞的CPE，免疫組化分析發現經藥物處理感染細胞在12hpi仍保持著細胞正常的多面體形狀，這都說明ASFV的復制受到了藥物的干擾。此外，上文提到的6種氟喹諾酮類抗生素以100μg/ml濃度使用7天后使得ASFV的核酸完全檢測不到了，一些藥物組合(25+25μg/ml或15+15+15μg/ml)也可以達到這種效果，且經藥物作用的培養液上清不能夠感染新的細胞培養物了。上述結果表明一些氟喹諾酮類抗生素對ASFV的繁殖的確有抑制作用，不過完全的抑制只發生在感染后早期使用這些抗生素后，這表明ASFV的拓撲異構酶可能在病毒感染的早期發揮較大作用。

　　氟喹諾酮類抗生素通過與細菌DNA回旋酶/4型拓撲異構酶以及細菌DNA結合形成藥-酶-DNA復合物，導致細菌基因組碎片化，進而抑制細菌DNA和RNA的復制和蛋白質的合成，致細菌快速死亡。本研究通過PFEG技術發現經藥物處理后，病毒的完整核酸或者不完整的核酸都減少了，但是病毒DNA碎片并未檢測到。合理的解釋就是要么氟喹諾酮類藥物對ASFV的作用機制與對細菌的不同，要么就是PFEG技術尚有不足。有其他研究人員已經指出，PFEG技術能檢測到從很小的DNA片段到250kb的DNA片段。鑒于氟喹諾酮類藥物能導致細菌形成很大的染色體碎片，再結合本試驗的結果，可知該藥物對ASFV的抑制作用與形成染色體片段是無關的。據此我們大膽推測，氟喹諾酮類藥物應是ASFV的2型拓撲異構酶的可逆的抑制劑，這與其對細菌的作用是不同的。

　　還需關注的一點，當ASFV感染的細胞培養物用依托泊苷處理后，并未見到ASFV基因的減少和病毒片段的增多。這說明宿主的2型拓撲異構酶并不切割病毒基因組，ASFV也并不需要宿主的這個酶。在病毒蛋白合成方面，免疫組化分析表明，無論在6hpi還是32hpi，經過藥物處理和未經藥物處理的ASFV感染的培養物在蛋白表達上有顯著的差別。

　　在缺乏有效疫苗的情況下，對非洲豬瘟的防控只能寄希望于嚴格的生物安全措施。而抗病毒藥物的使用，可以使得非洲豬瘟的防控更加快捷高效，本研究正是希望找到這樣一種抗病毒藥物。

　　本研究發現了6種氟喹諾酮類藥物能有效的抑制非洲豬瘟病毒生長。因此，這些藥物可以作為潛在的抗ASFV的工具。不過未來還需開展體內研究方能進一步證明其有效性。